Folge 5

Proteine und Peptide sind Eiweisse, die klassisch aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe extrahiert oder fermentativ hergestellt werden. Als Beispiel sei an dieser Stelle Insulin genannt, das seit 1923 und bis 1982 von Eli Lilly und Novo Nordisk kommerziell aus Rinder- oder Schweinebauchspeicheldrüsen gewonnen wurde.

Höhere Lebensqualität für Diabetiker
1978 gelang Genentech die Klonierung des menschlichen Insulin-Gens in dem Bakterium Escherichia coli. Dieses so genannte »rekombinante humane (rh) Insulin« konnte nun fermentativ in beliebiger Menge hergestellt werden. Damit stand erstmals Insulin in ausreichender Menge zur Verfügung. Das rh-Insulin erhielt 1982 die erste klinische Zulassung. Seither haben die drei grössten Insulinproduzenten (Novo Nordisk, Eli Lilly und Sanofi-Aventis) verschiedene gentechnisch modifizierte Insuline entwickelt, die durch schnellere oder verzögerte und längere Wirksamkeit die Lebensqualität der Diabetiker verbessert haben.

Unten: Das Bakterium Escherichia Coli wird zur industriellen Biosynthese von Insulin eingesetzt.

Anspruchsvoller Aufreinigungsprozess
Unabhängig davon, ob ein Protein aus einem Gewebe extrahiert wird oder es mittels Fermentation produziert wird, ist eine Aufreinigung erforderlich. Die Aufarbeitungsschritte von der Extraktion bis zum aufgereinigten Produkt werden im »Down Stream Processing« (DSP) zusammengefasst. Das DSP ist zum einen spezifisch für das Produkt, da man die speziellen Produkteigenschaften nutzt, um die Substanz von anderen zu trennen. Dennoch ähneln sich die Schritte und die zum Einsatz kommenden Technologien der Proteinaufreinigung.

Die Ziele einer Aufreinigung sind immer:
• Trennung des Produktes von der Biomasse (Gewebe oder Zellen aus der Fermentation)
• Anreicherung des Produktes aus der Fermentationsbrühe
• Grobreinigung von Verunreinigungen
• Schlussreinigung
• Stabilisation als Bulksubstanz

Ist das Zielprotein frei im Überstand einer Extraktion oder einer Fermentation verfügbar, so kann auf verschiedene etablierte Filtrations- und Zentrifugationstechniken zur Abtrennung der Biomasse zurückgegriffen werden. Für grössere Zellen (Pilzmyzel, marzerierte Gewebe) sind Filtrationen geeignet, für die Abtrennung kleinerer Zellen (Bakterien oder Hefen) sind selbstaustragende Zentrifugen/Separatoren oder Sedikanter geeigneter. Ist das Produkt in den Zellen eingeschlossen, so muss eine Extraktion (Lösungsmittel, Detergenzien) oder ein Zellaufschluss (mechanisch oder mittels Tensiden) der Biomasseabtrennung vorgeschaltet werden.

Schritt für Schritt zum konzentrierten Zielprodukt
In den nachfolgenden Schritten müssen das Produkt angereichert und Nebenprodukte abgereichert werden. Je höher dabei die Ausgangskonzentration des Zielproteins ist, desto effizienter wird sich die Aufreinigung gestalten.

Um ein Protein aus einer wässrigen Phase zu isolieren, bieten sich verschiedene chromatographische Verfahren an, bei denen das Produkt selektiv und reversi-bel an eine Matrix (Resin) gebunden wird. Im Idealfall würden Verunreinigungen nicht binden, in der Praxis werden diese teilweise binden. Durch entsprechende Waschschritte, bei denen das Zielprotein an der Matrix gebunden bleibt, können schwächer gebundene Verunreinigungen von der Matrix gewaschen werden. In der anschliessenden Elution wird dann das Zielprotein von stärker gebunden Begleitstoffen getrennt eluiert. Da das Volumen, in dem das Zielprotein eluiert wird, wesentlich kleiner ist als das Ausgangsvolumen, wird das Produkt zusätzlich konzentriert.

Verfahren bei monoklonalen Antikörpern
Die Bedingungen, pH, Salinität, Polarität des Systems, bestimmen im Einzelfall die Auswahl der Trennmatrix und das Chromatographieverfahren. Liegt ein salzhaltiges Fermentationsmedium, 0,5 bis >1 M Salz, vor, so bietet sich beispielsweise
die HIC (hydrophobe interaction chromatography) an. Ist der Salzgehalt niedrig,
bietet sich eine Ionenaustausch-Chromatography (IEX) an. In beiden Fällen sind kostengünstige Resins verfügbar. Zudem sind diese Resins auf hohe lineare Flussraten (L/cm) ausgelegt.

Teuer sind die Resins für die Affinitätschromatographien. Diese werden spezifisch für einen Prozess entwickelt und hergestellt und zeichnen sich durch eine ausgewählte hohe und exklusive Produktbindung aus. Dabei können Konzentrationsfaktoren von über 1000 erreicht werden. Diese Form der Chromatographie wird als erster Schritt in der Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern eingesetzt.

Ausschnitt des Bedienungsfeldes eines Gaschromatografen, dieser bestimmt unerwünschte Fremdstoffe während der Arzneimittelherstellung.

Tiefkühllagerung der Bulkware
Weitere Aufreinigungsschritte oder Produktbehandlungen sind spezifisch für das Produktionsverfahren. Für therapeutische Proteine aus Säugerzellen oder solche, die mit Zuschlagsstoffen tierischer Herkunft hergestellt werden, ist eine Virusabreicherung mittels Filtration, ionisierender Strahlung oder mit Lösungsmittel und Detergentien erforderlich.

Ausserdem wird zum weiteren Aufkonzentrieren des Produktes die Ultrafiltration eingesetzt. Im letzten Schritt einer Proteinaufreinigung steht in der Regel eine Gelfiltrationschromatographie, in der das Zielprotein aufgrund seiner Grösse von letzten Verunreinigungen getrennt wird. Diese Chromatographie ist allerdings technisch bedingt langsam und limitiert in dem Probenvolumen, das verarbeitet werden kann. Schliesslich wird ein so aufgereinigtes Protein als Bulkware in der Regel bis zu der weiteren Verarbeitung tiefgefroren gelagert.

Lösungsbeispiele für einen effizienten Aufarbeitungsprozess
Die besondere Herausforderung für die Planung einer solchen Aufarbeitung liegt in der Auswahl und Auslegung der verschieden denkbaren konzeptionellen Lösungen. So können die für die Chromatographien benötigten Puffer entweder individuell und ready-to-use vorgelegt oder als Pufferkonzentrate in einem zentralen Tanklager bewirtschaftet werden. Besonders die letztere Lösung bietet Vorteile in einem effizient genutzten Bufferansatzbereich. Allerdings ist die Auslegung einer solchen Anlage nur mit einer detaillierten Prozess-Simulation sinnvoll zu erreichen. Hierzu sind zum einen ein tiefgehendes Verständnis der zur Anwendung kommenden Prozesse erforderlich wie auch andererseits die Kompetenz, diese komplexen Prozesse zu modellieren. Beide Aspekte werden von Chemgineering breit abgedeckt, was erfolgreich durchgeführte Projekte in Deutschland und der Schweiz dokumentieren – Näheres dazu berichten wir Ihnen gerne auf Ihre Anfrage.

Dr. Wolfgang Minas